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紫外分光光度法測定蛋白質含量

更新時間:2016-07-18 點擊次數:3537

紫外分光光度法測定蛋白質含量

 

一、實驗原理

由于蛋白質分子中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵,因此蛋白質具有吸收紫外線的性質,吸收高峰在280nm波長處。在此波長范圍內,蛋白質溶液的光吸收值(OD280)與其含量呈正比關系,可用作定量測定。

利用紫外吸收法測定蛋白質含量的優(yōu)點是民迅速、簡便、不消耗樣品,低濃度鹽類不干擾測定。因此,在蛋白質和酶的生化制備中(特別是在柱層析分離中)得到廣泛應用。此法的缺點是:(1)對于測定那些與標準蛋白質酪氨酸和色氨酸含量差異較大的蛋白質,有一定的誤差;(2)若樣品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外線的物質,會出現(xiàn)較大的干擾。根據蛋白質和核酸的吸收高峰不同,并利用這一性質,通過計算可以適當校正核酸的干擾作用。

二、實驗用品

(一)器材

    (1) 752紫外分光光度計。

    (2) 移液管。

(3)試管及試管架。  

 

  (二)試劑

     標準蛋白質溶液:準確稱量經微量凱氏定氮法校正標準蛋白質,用重蒸餾水配制成濃度為1mg/ml的溶液。

   

    (三)材料

         待測蛋白質樣品溶液(用重蒸餾水適當稀釋)。

 

三、實驗程序

   1.標準法制作標準曲線

    取8支試管,按表1-1分別向每支試管加入各種試劑,搖勻。

選用光程為1cm的石英比色杯,在280nm處分別測定各管溶液的OD280值。以蛋白質濃度為橫坐標,OD280值為縱坐標,繪制標準曲線。

 

2.樣品測定

    取適當濃度的待測蛋白質溶液,同樣選用光程為1cm的石英比色杯,測定280nm處的光吸收值,并從標準曲線上查出待測定蛋白質的濃度。

 

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